最全Western blot经验大盘点,WB有这一篇就够了 | 合法藥品大搜索
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Western blot(蛋白印迹)作为科研研究中最为平常的实验,却蕴含了很多知识,可谓是小实验里却有大文章。尽管绝大多数研究僧在接触该实验时都会被虐的体无完肤,却也在和WB斗志斗勇的过程中积累了不少经验。正所谓前人种树,后人乘凉,现在小鱼就把各位前辈做WB的各种经验总结起来,希望对大家能有所帮助。
WB的基本原理
在电场的作用下将电泳分离的多肽从聚丙烯酰胺凝胶转移至一种固相支持体,然后用这种多肽的特异抗体来检测,经常用于目的蛋白的表达特性分析、组织定位、表达量分析及与其他蛋白的互作。依其原理,可分为两种方法:A、直接法和B、间接法。
经验总结:
1:合适的盐浓度下,保持蛋白质的最大溶解性和可重复性。
2:尽量除去核酸,多糖,脂类等干扰分子
3:提取蛋白质过程中,应在低温环境下进行,以抑制蛋白酶的水解作用(可加入适合的蛋白酶抑制剂)。
4:蛋白样品建议分装后冷冻干燥或直接以液体态置-80℃中保存,不要反复冻融。
5:蛋白浓度低时,可使用超滤膜浓缩或者用真空冻干机将蛋白冻干。
经验总结:
1:上样时:根据蛋白表达丰度调整蛋白上样量,尽量保证每孔上样量保持一致。
2:胶最好现配现用,如果需要保存,最好用湿润的保鲜膜包好并置于4℃冰箱中。
3:为了检测整个实验系统或校准实验结果,需要设置内参(一般指由管家基因编码表达的蛋白)。
4:为了确保western blot结果的准确性和特异性,设置合适正确的对照是必不可少,一般需...
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